Il lipofilling

L’idea di utilizzare il grasso corporeo come materiale di riempimento non è affatto recente: già alla fine dell’Ottocento sono infatti riportate in letteratura esperienze cliniche di reimpianto di tessuto adiposo a scopo riempitivo.

Nel 1989 Fournier introdusse la tecnica di iniezione del grasso non purificato come impianto autologo tramite siringa, che nominò liposcultura o lipofilling (Fournier P. 1985). Da allora, la procedura si è notevolmente diffusa con finalità sia estetico-riempitive sia ricostruttive e funzionali.

Il lipofilling consiste in un semplice innesto di tessuto: mediante apposite ago-cannule, le cellule adipose vengono prelevate dallo stesso soggetto che deve sottoporsi all’intervento e impiegate come materiale infiltrativo per rimodellare, attraverso il riempimento, alcune forme che risultano svuotate.

Tecnicamente l’innesto è definito come il trasferimento di uno o più tessuti, che perdono qualsiasi connessione vascolare con la loro sede di origine. Questo significa che il tessuto trasferito può sopravvivere nella nuova sede soltanto se si trova a diretto contatto con altri tessuti ben vascolarizzati, dai quali trarrà nutrimento, inizialmente per semplice imbibizione e successivamente formando nuove connessioni vascolari. E’ quindi evidente che, se il grasso viene iniettato in grandi quantità, non tutte le cellule adipose saranno a contatto con tessuti vascolarizzati e andranno conseguentemente incontro ad apoptosi, necrosi e riassorbimento.

In questa semplice osservazione è racchiuso il limite principale del lipofilling: non si possono effettuare delle correzioni su grosse dimensioni senza che parte dell’innesto vada incontro a riassorbimento, a causa della mancata vascolarizzazione di parte di esso. Il lipofilling è indicato per fare solo dei piccoli ritocchi.

Su queste basi, il Dottor Sidney Coleman ha sviluppato la tecnica della lipostruttura che rappresenta un’evoluzione del lipofilling. Questa metodica prevede che la raccolta del grasso venga effettuata con siringhe molto piccole ed aspirando a bassa pressione per ridurre il traumatismo del processo sulle cellule adipose; che il grasso aspirato venga centrifugato per separare le cellule adipose vitali da quelle danneggiate e dai loro sottoprodotti, escludendo le impurità; e che l’infiltrazione del grasso avvenga in tanti piccoli canali, ciascuno contenente una minima quantità di tessuto adiposo, a diretto contatto con tessuti ben vascolarizzati. La rete dei canali nei quali si infiltra il grasso crea una struttura disposta su vari strati (da qui il nome della procedura) che favorisce la rivascolarizzazione.

Il grasso corporeo viene così sfruttato come filler (riempitivo) per la correzione di numerosi difetti dovuti a traumi facciali, per malattie congenite, per la ricostruzione del seno post-mastectomia e per il trattamento di cicatrici della più svariata natura. In quest’ultimo caso, studi clinici hanno dimostrato che il lipofilling permette un considerevole miglioramento delle caratteristiche estetiche, nella morbidezza, nello spessore e nell’elasticità della pelle. Le cellule staminali multipotenti presenti all’interno del grasso aspirato sono infatti ottimali per la rigenerazione tissutale a livello di una cicatrice di vecchia data.

Il lipofilling ha rivoluzionato anche il trattamento chirurgico degli esiti di mastectomia dovuta al cancro al seno, offrendo alle pazienti una tecnica sicura e poco invasiva e dimostrandosi utile in tutte quelle donne che hanno rifiutato o hanno presentato controindicazioni alle classiche tecniche di ricostruzione mammaria.

Nel campo della chirurgia estetica, il lipofilling ha trovato larga utilizzazione nell’aumento volumetrico dei glutei con ridefinizione dei suoi profili, nel ringiovanimento del volto, nel ringiovanimento delle mani, nell’aumento del volume delle labbra, nel trattamento delle cicatrici acneiche e nella correzione delle occhiaie.

Infine di fondamentale importanza è stata la scoperta clinica di cellule staminali multipotenti (AMSC, Adipose Mesenchymal Stem Cells) all’interno del grasso aspirato (Coleman S.R. 2006; Gronthos S. et al. 2001). A seconda dello scaffold (struttura di sostegno), queste cellule sono capaci di differenziare in cellule ossee, cartilaginee, muscolari e cardiache, endoteliali e nervose, caratteristica che consente trattamenti estremamente efficaci soprattutto in campo ricostruttivo in caso di esito di traumi, ulcere croniche, danni da radioterapia e che ha notevolmente incrementato le indicazioni all’impiego del lipofilling, prima fra tutte la rigenerazione tissutale.

Con l’emergere della medicina rigenerativa e la ricostruzione tissutale, è infatti considerevolmente aumentato l’interesse verso il tessuto adiposo che, proprio per il suo alto contenuto di cellule staminali, possiede un elevato potenziale terapeutico.


Il lipofilling viso
Un viso invecchiato mostra sia segni dovuti alle influenze esterne come raggi UV, il danno da radicali liberi con macchie attiniche, elastosi solari, teleangectasie e rughe, sia segni intrinseci dell’invecchiamento che si verificano più in profondità nel tessuto sottocutaneo con zone atrofiche.
L’invecchiamento od un eccessivo dimagrimento portano alla perdita di volume di alcune zone del viso come la regione degli zigomi e delle guance.

Il lipofilling è una tecnica chirurgica, che grazie all’innesto di cellule adipose e staminali prelevate da altre zone del corpo, permette di ridisegnare, ripristinare volumi e contorni, ringiovanire, dare maggiore definizione al volto e correggere l’atrofia che accompagna la senescenza; ma anche difetti estetici dovuti all’acne, la concavità a livello temporale, rughe delle pieghe naso-labiali e l’atrofia emifacciale.

L’innesto di grasso autologo è un opzione permanente per molti pazienti che sono alla ricerca di un coutouiring estetico del viso, anche se potrebbero essere necessari dei piccoli ulteriori interventi dopo quello iniziale a distanza di 3-6 mesi.
Dal momento che questa tecnica prevede l’utilizzo di cellule adipose autologhe, non si possono sviluppare intolleranze o reazioni allergiche e essendo poco invasiva il paziente in circa 7-10 giorni potrà tornare a svolgere qualsiasi tipo di attività lavorativa e sociale.
Con questa tecnica possono essere inoltre corretti difetti post-traumatici o post-chirurgici.
Dalla nostra esperienza l’innesto di grasso autologo rappresenta una valida opzione per il ringiovanimento del viso, effettuato singolarmente o in associazione al lifting.


Lipofilling glutei
La tecnica chirurgica del lipofilling è indicata per dare maggior definizione ad alcune aree corporee come il gluteo.
Lo scopo è quello di aumentare il volume dei glutei con un innesto autologo di grasso intramuscolare tramite una tecnica sicura, priva di cicatrici o segni visibili, con risultati naturali e duraturi. Si offre al paziente un risultato prevedibile con un aumento proporzionale adeguato al proprio corpo e un rimodellamento offrendo una silhoutte naturale e simmetrica.

Il movente principale per i consulti sui glutei è quello di creare una silhoutte soddisfacente esteticamente, anche se alcuni pazienti si rivolgono al chirurgo per correggere difetti secondari a cicatrici da incidenti o anche segni ereditari.

Il prelievo del tessuto adiposo necessario al rimodellamento del gluteo tramite il lipofilling, viene eseguito generalmente in associazione alla liposcultura, poichè per ottenere un aumento di volume del gluteo è necessario circa 200-500cc di grasso per lato; per questo motivo è indispensabile la presenza di abbondante tessuto adiposo da poter prelevare in altre zone corporee.

Quindi questo intervento ci permette di raggiungere due obiettivi: aumento volumetrico del gluteo con un contorno più sottile e ben definito, una migliore proiezione visiva dei glutei e la riduzione di tessuto adiposo dalle aree in eccesso.
Oltre all’innesto di grasso autologo, è possibile attuare una gluteoplastica per mezzo di protesi o l’uso di materiale biocompatibile come l’acido ialuronico (macrolane).
L’intervento di gluteoplastica è indicato nel caso di glutei piatti, poco rotondi e rilassati. L’impianto delle protesi glutee è particolarmente indicato nei pazienti che presentano una corporatura troppo magra e quindi con impossibilità di prelievo del grasso autologo. L’impianto viene posizionato tramite un’incisione di pochi centimetri nella parte superiore del solco intergluteo o nel limite superiore del gluteo o nei solchi alla base dei glutei, e la protesi viene inserita generalmente sotto fasciale (al disopra del muscolo grande gluteo), intramuscolare, o sottomuscolare.

Il lipofilling può essere effettuato in associazione con intervento di gluteo plastica con protesi per aumentare lo spessore sottocutaneo, per migliorare la silhoutte della regione e per prevenire eventuali contratture capsulari.


Lipofilling mammario estetico
Nella chirurgia estetica della mammella l’infiltrazione di grasso autologo trova ampie applicazioni: piccole mastoplastiche additive, correzioni di asimmetrie mammarie, correzioni da difetti di ricostruzione con protesi, aumento di spessore dei tessuti molli sopra la protesi, contratture capsulari e deformità del seno tuberoso.

Questa tecnica è indicata per molteplici aspetti in quanto è priva di esiti cicatriziali, otteniamo un risultato naturale e inoltre è consigliata per quelle pazienti che rifiutano o sono intolleranti alla presenza di un corpo estraneo all’interno del proprio organismo.
Per molti anni l’uso del lipofilling per interventi di mastoplastiche additive è stato ampiamente criticato in quanto il grasso innestato poteva provocare cicatrici e calcificazioni derivanti dalla liponecrosi; queste potevano simulare o nascondere una lesione cancerosa alla mammografia.
Brown e coll. hanno presentato uno studio retrospettivo dimostrando che tutte le procedure chirurgiche sulla mammella provocano noduli e alterazioni mammografiche, ma hanno dimostrato anche che le differenze tra modifiche benigne post-operatorie e quelle che rappresentano il carcinoma della mammella sono evidenti.
Unanime è la certezza che lo screening radiologico e la diagnosi differenziale con noduli neoplastici della mammella non subiscono interferenze da tale intervento e che il lipofilling è considerato e dimostrato dalla comunità scientifica essere un intervento sicuro anche nella chirurgia della mammella.

Il lipofilling trova ampio impiego inoltre come tecnica adiuvante la mastoplastica additiva con protesi, infatti possono a volte residuare piccole zone di contorno irregolare e fastidiose pieghe; innestando grasso autologo è possibile correggere tali difetti.
Inoltre può essere anche utilizzato per correggere la contrattura capsulare di grado 3° - 4°.

Il lipofilling del seno si esegue in sala operatoria in anestesia generale in regime di day-hospital, ed è associato generalmente ad una liposcultura della zona di prelievo che principalmente è rappresentata da addome, fianchi e regione trocanterica.



Cellule staminali da tessuto adiposo
Il tessuto adiposo umano rappresenta oggi un duplice aspetto contrastante: se da una parte drastici cambiamenti nel volume della massa adiposa, come l’obesità e le lipodistrofie, sono considerati fattori di rischio per lo sviluppo di condizioni patologiche come squilibri metabolici e insulino-resistenza, che portano allo sviluppo di diabete e patologia cardiovascolari, dall’altra parte recentemente il tessuto adiposo è stato rivalutato come organo importante dopo la scoperta del suo contenuto di una sottopopolazione di cellule staminali mesenchimali stromali (MSCs). E’stato infatti ampiamente dimostrato che il tessuto adiposo, derivante dal mesenchima embrionale esattamente come il midollo osseo, contiene una grande popolazione di cellule staminali all’interno del suo compartimento stromale.

La cellula staminale
Definizione: La cellula staminale è una cellula non differenziata, capace di replicarsi indefinitamente; ad ogni sua suddivisione dà origine a due cellule figlie delle quali una è staminale anch’essa, l’altra è capostipite di una popolazione di cellule che a loro volta danno luogo a cellule mature differenziate ovvero ai tessuti distinti. La cellule staminali assicurano in questo modo la formazione e il rinnovamento tissutale tramite la sostituzione delle cellule che terminano il loro ciclo vitale o che vengono lesionate,danneggiate e che vanno incontro a morte.
Nell’adulto la capacità proliferativa delle cellule indifferenziate è diversa nei tessuti che, per tale motivo, presentano differente capacità di rinnovamento e nell’istologia classica vengono distinti in tessuti labili, stabili e perenni.
Molte ricerche a partire dagli anni '90 hanno rilevato caratteristiche prima inaspettate, come la capacità di alcune cellule staminali adulte di trasformarsi in cellule di tessuti diversi da quelle a cui appartengono (transdifferenziazione).
In sintesi, la cellula staminale è caratterizzata da:

- capacità di auto-rinnovamento
- vitalità a lungo termine
- potenzialità di differenziamento multilineare.

Tipi di cellule staminali
In base alla capacità di generare qualsiasi tipo di tessuto, oppure alcuni o uno soltanto, le cellule staminali si dicono rispettivamente multi o pluripotenti e unipotenti.
In base alla provenienza si distinguono in cellule staminali embrionali, fetali, da cordone ombelicale e adulte.

Cellule staminali embrionali eterologhe
Nell’embrione, allo stadio della blastocisti, prima del suo annidamento nella parete dell’utero, si ritrovano cellule staminali totipotenti e altamente proliferative, cioè capaci di produrre un numero assai elevato di progenitori di qualsiasi tipo di tessuto; queste cellule possono essere coltivate in vitro e mantenute inalterate per anni. Hanno diverse interessanti applicazioni: sono in grado di integrarsi in un embrione senza alterarne lo sviluppo e differenziarsi nei diversi tessuti del nuovo organismo; possono essere indotte a differenziarsi in un determinato tipo cellulare, come neuroni, cellule muscolari cardiache e progenitori degli elementi sanguigni. Cellule staminali ottenute in grande quantità da embrioni congelati derivanti da procedure di fecondazione in vitro, eccedenti per tale finalità, e donati previo consenso informato, potrebbero teoricamente essere utilizzate per ricerche sui meccanismi di differenziamento dei tessuti oppure a scopo terapeutico per trattamenti immunologici sul feto all’inteno all’interno dell’utero o al momento della nascita.
E’ tecnicamente possibile anche prelevare alcune cellule staminali dell’embrione senza sopprimerlo, in fasi ancora precoci dello sviluppo ( stadio di morula o blastula); qui subentra però il problema di dover amplificare le cellule staminali embrionali in modo artificiale per garantirne un numero sufficiente per le loro possibili applicazioni.
Una ulteriore fonte di cellule staminali embrionali è costituita dalle cellule germinali primordiali presenti all’interno delle gonadi del feto capostipiti delle cellule riproduttive. Le cellule staminali così ottenute sono dette eterologhe perché provenienti da un individuo e utilizzate per trattare un individuo diverso.

Cellule staminali autologhe
Le cellule staminali autologhe possono essere trapiantate nello stesso donatore (autotrapianto) ed essere così compatibili dal punto di vista immunitario. La possibilità di ottenere questo tipo di cellule apre nuove prospettive terapeutiche. Mediante la tecnica di trasferimento nucleare (TNSA), il nucleo di una cellula somatica viene iniettata in una cellula uovo precedentemente privata del proprio nucleo; La cellula così ottenuta, con il nuovo nucleo può essere indotta mediante fattori di crescita a svilupparsi in vitro in un embrione da cui verranno prelevate le cellule staminali; oppure può essere moltiplicata in masse di cellule che vengono poi indotte a differenziarsi verso un certo tipo di tessuto.

Cellule staminali fetali
Le cellule staminali fetali sono finalizzate all’accrescimento di aluni tessuti del neonato, con caratteristiche intermedie tra le cellule dell’embrione e quelle dell’adulto. A livello pratico, possono essre prelevate da feti abortivi.

Cellule staminali da cordone ombelicale
E’ possibile isolare cellule staminali dotate di grande capacità proliferativa dal sangue fetale prelevato dal cordone ombelicale. Allo stato attuale sono considerate precursori degli elementi sanguigni. Alcuni ricercatori propongono l’istituzione di banche di cellule staminali autologhe, nelle quali ciascun individuo possa conservare le proprie cellule staminali autologhe prelevate al momento della nascita dal cordone ombelicale, di modo da poterle utilizzare come autotrapianto in caso di necessità.

Cellule staminali adulte
Le cellule staminali dell’adulto permettono la riparazione dei tessuti danneggiati. Verso la fine degli anni Novanta è stato dimostrato che le cellule tissutali adulte non si differenziano solo nel tipo di cellula del tessuto a cui appartengono, ma hanno al contrario hanno capacità differenziative multiple che sono ancora in fase di studio e hanno la capacità di auto-rinnovarsi: questo lo fanno continuando a mantenere sempre le loro specifiche caratteristiche cellulari.
Il midollo osseo contiene cellule staminali ematopoietiche ed è considerato come la fonte maggiormente riconosciuta di cellule staminali mesenchimali; esse si trovano nello stroma del midollo, e possiedono la potenzialità di differenziarsi in molteplici linee cellulari come gli adipociti, osteociti, condrociti, miociti e neuroni in vitro.Le cellule staminali vengono generalmente ottenute tramite aspirazione del midollo osseo che deve essere trapiantato. Quando vengono messe in coltura in vitro, le cellule staminali del midollo osseo presentano una morfologia simile ai fibroblasti. Sono inoltre stati identificati i marcatori specifici di tali cellule, che ne permettono la loro determinazione e preparazione in popolazioni cellulari. Sono stati effettuati numerosi studi sulle cellule staminali mesenchimali stromali adulte, e sulla base del fatto che il tessuto adiposo, esattamente come il midollo osseo, ha origine dal mesenchima, è stato dimostrato che esso rappresenta un’abbondante fonte di cellule staminali. Recenti studi hanno affermato che anche tessuti perenni cone quello nervoso e pancreatico contengono un certo numero di cellule staminali capaci di differenziarsi in più linee cellulari. Con queste proprietà , è possibile sfruttare la pluripotenzialità delle cellule staminali adulte coltivando in vitro cellule di un tessuto e inducendone il differenziamento in modo da poter intervenire nella ricostruzione di tessuti lesionati in modo autologo, trapiantando cioè cellule dello stesso paziente ed evitando dunque il fenomeno del rigetto.


Il tessuto adiposo come fonte di cellule staminali
Il tessuto adiposo è stato identificato come una ricca fonte di cellule multipotenti che hanno la capacità di differenziarsi in linee cellulari adipogeniche(91,96) condrogeniche(88, 89, 91) miogeniche(91, 94) e osteogeniche(28,91-94,) quando messe in coltura assieme a stimolatori specifici verso una determinata linea cellulare.
Patologie umane supportano il concetto che il tessuto adiposo contenga progenitori cellulari multi potenti.

Eteroplasia ossea progressiva (POH)
Bambini affetti da una rara patologia come l’eteroplasia ossea progressiva (POH) si presentano ai medici con sintomatologia correlata alla formazione di tessuto osseo ectopico all’interno dello strato di tessuto adiposo sottocutaneo. Analisi istologiche di tali lesioni dimostrano la presenza di osteoblasti e condrociti oltre agli adipociti. POH è una malattia autosomica dominante associata alla mutazione del gene GNAS1 responsabile del legame tra ormone e recettori trans membrana all’adenilato ciclasi. Influenze epigenetiche determinano la modalità di manifestazione della patologia. L’imprinting del gene attribuito a trasmissione paterna dell’allele inattivo del gene GNAS1 causa la POH, mentre se il difetto è ereditato dalla madre, si manifesterà uno pseudoipoparatiroidismo.
Quindi un errore metabolico innato implica che cellule staminali derivanti dal tessuto adiposo possono essere tripotenti, con possesso di potenziale adipogenico, condrogenico e osteogenico.

Lipomi e Liposarcomi
Vari tumori dei tessuti molli danno un ulteriore peso all’esistenza di cellule staminali derivate dal tessuto adiposo. I lipomi e liposarcomi sono i più comuni tumori dei tessuti molli riscontrati in ambito clinico. Spesso questi tumori si presentano a livello dei depositi di grasso del sottocutaneo o viscerale e proliferano lentamente. Il contenuto dei lipidi dei lipomi benigni e dei liposarcomi ben differenziati è paragonabile a quello del tessuto adiposo normale. Al contrario, i lipomi mixoidi e i liposarcomi indifferenziati hanno un contenuto di trigliceridi inferiore. Il recettore dell’ormone nucleare associato all’adipogenesi, PPAR ? (peroxisome proliferator-activeted receptor), può essere riscontrato in tutti i gradi istologici del liposarcoma. I ligandi per il fattore di trascrizione di PPAR? sono composti naturali (acidi grassi a catena lunga, prostaglandine j2) e sintetici (tiazolinedione)e in vitro, questi agenti possono indyrre le cellule derivate dal liposarcoma a differenziarsi in adipociti. Sulla base di queste osservazioni, è stato usato tiazolinedione orale nel trattamento di pazienti con liposarcomi riducendo in questo modo la proliferazione cellulare e incrementando l’espressione di marcatori dei geni adipocitici. Anche se resta da stabilire se l’adipogenesi indotta dal ligando sia una terapia efficace per i pazienti con liposarcoma, questo studio è coerente con l’ipotesi che i liposarcomi derivano da cellule staminali progenitrici.

Obesità
Questa rappresenta un’ulteriore supporto all’esistenza di cellule staminali a livello dei depositi di tessuto adiposo. In tutto il mondo l’incidenza degli individui obesi e in sovrappeso è cresciuto in modo allarmante. A ciò contribuiscono svariati fattori sia di tipo genetico, epigenetico che comportamentale. Modelli di adipogenesi in vivo suggeriscono che l’adipocita maturo è una cellula differziata terminale con limitate capacità differenziative e re plicative. Tuttavia studi con traccianti radioattivi hanno riscontrato che il tasso di ricambio delle cellule adipose varia tra i 6 e i 15 mesi negli esseri umani e nei roditori. Presumibilmente è presente una popolazione di cellule staminali in questo tessuto, responsabile della replicazione degli adipociti maturi nel corso della vita. Alcuni autori hanno proposto che un meccanismo omeostatico mantiene il totale volume del tessuto adiposo a livelli costanti(21) non solo dovuto all’aumento di volume degli adipociti preesistenti ma anche attraverso la generazione di nuovi adipociti dal pool di cellule staminali progenitrici.
Il tessuto adiposo deriva dallo stato mesodermico dell’embrione e si sviluppa sia nel periodo prenatale che postnatale. Comincia a comparire verso il secondo trimestre della gravidanza e verso il 50°- 70° giorno di gestazione si identificano i preadipociti che sono stati studiati tramite anticorpi monoclonali. La loro comparsa coincide con quella dei fibroblasti. Con la maturazione gli adipociti accumulano lipidi in modo multi o uniloculare.

La localizzazione delle cellule progenitrici è rimasta per lungo tempo controversa e ciò lo dimostra la molteplicità dei nomi che sono stati attribuiti a tali cellule nel corso degli anni; il dubbio rimaneva sull’origine endoteliale, pericitica o stromale. I preadipociti e le cellule endoteliali condividono antigeni di superficie comuni, in accordo con un’origine comune. Studi sperimentali e pratiche cliniche dimostrano che le cellule staminali isolate dal tessuto adiposo appartengano alla componente vascolo-stromale.
Sebbene gli studi ancora siano limitati, specifiche differenze sembrano presentarsi a livello di diversi distretti di tessuto adiposo sul contenuto di cellule staminali. Studi sul tessuto adiposo murino dimostrano che il numero e il potenziale differenziativo delle cellule staminali è molto più abbondante a livello del tessuto adiposo bianco rispetto a quello bruno. Nell’uomo è stato osservato che il numero maggiore di cellule staminali viene raccolto dal tessuto adiposo sottocutaneo a livello del braccio rispetto a coscia, addome e seno.(30). Resta ancora da determinare da quale sito dovrebbe essere raccolto il grasso per ottenere un recupero ottimale di cellule staminali.


Isolamento delle cellule staminali
Le prime metodologie impiegate per l’isolamento delle cellule del tessuto adiposo furono messe in pratica da Rodbell e colleghi nel 1960. Il grasso veniva estratto chirurgicamente, macinato manualmente, lavato a lungo per rimuovere le cellule ematopoietiche contaminanti e incubato con collagenasi per eliminare la matrice extracellulare. Il materiale così ottenuto veniva poi centrifugato per separare la popolazione degli adipociti maturi dalla frazione vascolo-stromale (SVF) costituente il pellet.
La frazione vascolo-stromale è costituita da una componente cellulare eterogenea, includendo cellule del sangue circolanti, fibroblasti, periciti e cellule endoteliali, in questo caso meglio definite come pre-adipociti. L’ultimo passo consisteva nell’isolare la componente di cellule aderenti ad un materiale plastico dalla SVF, ricca in preadipociti.
Successivamente, con l’introduzione della liposuzione l’isolamento delle cellule adipose è stato semplificato e reso quindi meno traumatico per il paziente. IL sottocutaneo viene infiltrato da soluzione salina contenete anestetico e adrenalina; si procede quindi all’aspirazione del grasso tramite l’uso di cannule dal cui diametro dipende il volume del campione e il suo mescolamento. Studi sperimentali hanno dimostrato che la liposuzione non altera in modo significativo la vitalità delle cellule che vengono isolate in seguito dalla frazione vascolo-stromale cellulare.
Le ASCs vengono isolate tramite un primo lavaggio del campione di tessuto con soluzione salina fosfato - tamponata (PBS: phosphate-buffered-saline) contenente 5% di penicillina/streptomicina (P/S), per la rimuovere i detriti e l’anestetico locale. Il campione di tessuto lavato poi viene posto su una piastra di coltura sterile contenente 0,075% di Collagenasi Tipo I per eliminare la componente extracellulare, incubandolo a 37°C per 30 minuti. La collagenasi viene poi inattivata da una soluzione (DMEM: Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) contenente un 10% di siero fetale bovino (FBS). L’infranatante è centrifugato per ottenere un pellet cellulare ad alta densità. Il pellet è risospeso nella soluzione contenete FBS a 37°C con aggiunta di soluzione per lisi eritrocitaria ( 0,16 M NH4Cl) per 10 minuti. Viene eseguita poi un’ulteriore centrifuga seguita da risospensione del pellet in DMEM 10% FBS e posto poi su un piatto di coltura ad una densità di 1x10^6 cellule per piatto. Generalmente per questo processo vengono impiegate 2 ore e possono essere ottenuta da 2 a 8x10^8 cellule di lipoaspirato processato (PLA) da 300 ml di grasso ottenuto con liposuzione. Il PLA viene poi mantenuto In un mezzo di controllo (CM: DMEM 10% FBS, 1% antibiotico/antimicotico) a 37°C e al 5% di CO2. Il mezzo di coltura viene cambiato 2 volte alla settimana.
Il recupero delle ASCs può essere migliorato ulteriormente migliorando a sua volta la modalità di centrifugazione. E’ stato osservato che la raccolta ottimale di cellule staminali si raggiunge con una centrifugazione a 1200g. Inoltre il campione centrifugato non può essere conservato a temperatura ambiente oltre le 24 ore, perché aumenta la probabilità che le cellule non siano più vitali.


Composizione del PLA
Il lipoaspirato così trasformato, è ritenuto essere costituito da una popolazione cellulare eterogenea includendo cellule endoteliali, fibroblasti, cellule muscolari lisce e preadipociti. Il fenotipo del PLA è stato caratterizzato mediante uno studio indiretto con immunofluorescenza. Sono stati utilizzati anticorpi monoclonali specifici : anti-fattore VIII per identificare le cellule endoteliali; anti-Actina del muscolo liscio per identificare cellule muscolari lisce e periciti; anti-ASO 2 per identificare i fibroblasti e le cellule di origine mesenchimale. Dai risultati la maggior parte delle cellule costituenti il PLA appare positiva alla marcatura con anticorpi anti-ASO 2. Sono inoltre osservati bassi livelli di cellule marcate con anticorpi anti-Fattore VIII e anti-Actina del muscolo liscio. Quindi ciò dimostra che il PLA è costituito principalmente da cellule di origine mesenchimale con bassi livelli di contaminazione con cellule endoteliali, muscolari lisce e periciti.

Immunofenotipo
Sono stati effettuati molti studi sull’immunofenotipo di superficie presentato dalle ASCs isolate. Dopo 2 o più passaggi successivi in coltura esse presentano una caratteristica capacità di adesione, esprimono specifici recettori molecolari e enzimi di superficie, matrice extracellulare, proteine del citoscheletro e proteine associate al fenotipo cellulare stromale.
L’immunofenotipo delle ASCs è relativamente costante tra i diversi laboratori nonostante tecniche diverse di isolamento e di coltura. E’ stato infatti dimostrato che questo è molto simile all’immunofenotipo delle cellule staminali mesenchimali ottenute dal midollo osseo(MSCs) e a quelle derivanti dal muscolo scheletrico.
Tramite confronti diretti, la compatibilità dell’immunofenotipo delle ASCs e delle MSCs è stata dimostrata essere maggiore del 90%.(52).
In accordo con questa dimostrazione, le due popolazioni cellulari mostrano una simile fosforilazione di una protein-kinasi mitogeno-attivata in risposta al TNF-a, lipolisi in risposta ad agenti ß-adrenergici e secrezione di adiponectina e leptina seguente all’adipogenesi. Il restante 10 % è caratterizzato dall’espressione di diverse proteine di superficie che caratterizzano le due popolazioni cellulari.
E’ stato dimostrato che la positività al CD34 tramite tecniche di citometria a flusso, costituisce una popolazione cellulare all’interno della frazione vascolo-stromale contenente ASCs.
Studi di ingegneria genetica hanno analizzato i trascrittomi delle ASCs e delle MSCs ed è stato visto che la composizione dei geni tra le due popolazione non appare significativamente differente.


Proliferazione e coltura cellulare
In vitro le ASCs mostrano un tempo di duplicazione che va dai 2 ai 4 giorni dipendendo in gran parte dal mezzo di coltura.
Queste cellule hanno la capacità di mantenere invariata la lunghezza dei telomeri durante i vari passaggi replicativi. Tali rapporti variano però in base all’attività della telomerasi delle ASCs, che può rimanere costante, ridursi oppure essere assente.
E’ stato notato che con passaggi replicativi di durata superiore ai 4 mesi, le ASCs vanno verso una trasformazione maligna(83). Il 30 % delle ASCs messe in coltura, dopo una lunga serie di passaggi, hanno mostrato anomalie del cariotipo. Queste, impiantate in un ratto, hanno mostrato la capacità di trasformazione tumorale con una frequenza del 50%. Di conseguenza è necessaria la massima cautela nella manipolazione e nella coltura delle ASCs.


Differenziazione delle ASCs
Le ASCs mostrano una multi potenzialità, ossia mantengono la capacità di potersi differenziare in multiple linee cellulari diverse.
Esse possono differenziarsi nella maggior parte dei tipi cellulari mesenchimali, includendo gli adipocit,gli osteoblasti, i condrociti e i miociti. La differenziazione verso la linea nervosa o verso un tessuto di origine ectodermica fu considerata inizialmente essere improbabile, avendo le cellule adipose un’origine mesodermica. Tuttavia è stato notato che le ASCs esposte ad antiossidanti in vitro, in assenza di siero, assumono una morfologia bipolare simile ai neuroni. E’ emerso inoltre che le ASCs possono fornire un supporto angiogenico e possibilmente ematopoietico.
L’abilità differenziativa di tali cellule ha suscitato grande interesse verso il valore del loro potenziale terapeutico nella medicina rigenerativa.


Linee mesenchimali

- Adipogenesi:
in laboratorio la differenziazione delle ASCs in adipociti impiega circa 14giorni; dopo tale periodo i lipidi intracellulari possono essere osservati tramite colorazione con “Oil Red O”. Il gene o il fattore responsabile del segnale che porta le cellule staminali verso la linea adipocitica non è conosciuto. Tuttavia gli stimolatori più importanti sono l’insulina e i glucocorticoidi. In vitro il primo passo verso l’adipogenesi è stimolato dall’insulin-like growth-factor (IGF-1). L’ormone della crescita (GFH), glucocorticoidi, insulina e acidi grassi stimolano l’adipogenesi sia nelle fasi precoci che tardive della differenziazione. La triiodiotironina (T3) stimola solo l’ultima fase dell’adipogenesi. In seguito il mezzo di induzione dell’adipogenesi è generalmente integrato con un induttore di AMPc come l’isobutil-metilxantina.
Alte concentrazioni di retinoidi insieme con citochine come l’interferone (INF) l’interleuchina-1 e 2 (IL-1; IL-2) il fattore di crescita trasformante ß (TGF-ß) e il fattore dinecrosi tumorale (TNFa), inibiscono fortemente l’adipogenesi; tali fattori devono quindi essere esclusi dal terreno di coltura.
Al contrario l’applicazione di fattori di crescita angiogenetici come il fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF), il fattore di crescita fibroblastico-2 e il fattore di crescita piastrinico-BB hanno mostrato che, in combinazione, portano allo sviluppo di una angiogenesi precoce e all’incremento di crescita del tessuto adiposo in un periodo di 6 settimane.

- Osteogenesi:
in vitro la differenziazione verso osteogenica impiega circa 28 giorni, dopo cui possibile osservare tramite colorazione al 2% di Alizarina rossa, la calcificazione della matrice extracellulare.
La maggior parte degli studi dimostra che il dexametasone è un componente fondamentale per la stimolazione dell'oteogenesi, anche se il suo esatto meccanismo d’azione rimane ancora sconosciuto. In uno studio parallelo il dexametasone è stato sostituito con l'1,25 di idrossi-vitamina D3. L’acido ascorbico ha la funzione di co-fattore nell'idrossilazione dei residui di lisina e prolina della catena del collagene e aumenta la sintesi delle proteine della matrice ossea non collageno sica. E' fondamentale anche il B-glicerofosfato che è essenziale per la calcificazione e la mineralizzazione della matrice extracellulare. Pertanto, per stimolare l’osteogenesi, il mezzo di coltura deve essere integrato con dexametasone o vitamina D3, acido ascorbico e B-glicerofosfato.

- Condrogenesi:
in laboratorio la condrogenesi è indotta dall’aggiunta d insulina, TGF-ß1 e acido ascorbico(con o senza dexametasone) al mezzo di coltura. L’aumento dell’espressione delle proteine della matrice extracellulare cartilaginea si ha quando le cellule vengono sospese in un gel di alginato di calcio 3-D, permettendo di sviluppare in qualche settimana il collagene di tipo II e di tipo IV. Tecniche di coltura ad alta densità cellulare possono imitare condizioni in vivo e facilitare il cambiamento fenotipico delle cellule in densi noduli condrogenici. Quando le cellule si trovano però un unico strato i markers genetici sono presenti ma a concentrazioni ridotte. Nonostante ciò la condrogenesi dalle ASCs non sembra essere ancora efficiente in coltura. Winter e colleghi hanno eseguito uno studio che ha messo a confrontole ASCs e le BMSCs il quale ha dimostrato che le ASCs sono meno sensibili alla manipolazione condroinduttiva in coltura, e dopo un periodo di più di due settimane la loro differenziazione è risultata essere meno completa elle BMSCs.


Linee non mesenchimali

- Muscolo scheletrico:
la differenziazione delle ASCS in cellule miogeniche si ottiene tramite l’aggiunta al mezzo di coltura 5% di siero di cavallo e glucocorticoidi come l’idrocortisone e/oil dexametasone. In queste condizioni le cellule staminali si fondono e formano miotubi multi- nucleati, markers proteici dei miociti. Tuttavia la differenziazione muscolare si ha con il rendimento e riproducibilità più bassi fra tutti i tipi cellulari.

- Muscolo cardiaco:
sia le ASCs che le MSCs hanno mostrato possedere la capcità di differenziamento in vitro verso cellule miocardiche. I risultati più convincenti sono stati ottenuti da Planat-Bernard e colleghi ponendo le ASCs su un piatto di coltura semisolido. Dopo tre settimane sono state osservate colonie di cellule con molte proprietà elettrofisiologiche, farmacologiche e molecolari di cellule miocardiche. Con analisi istologiche è stato visto che le cellule esprimono markers cardiomiocitici.

-Neurogenesi:
il trattamento delle ASCs con beta-mercaptoetanolo determina una rapida trasformazione delle cellule verso una morfologia neuronale, e l’espressione di markers includendo la nestina, l’enolasi neurono-specifica (NSE) e la proteina specifica neuronale (NeuN), ognuno dei quali diventa precocemente un marker della linea neuronale. Sono stati ottenuti risultati simili con condizioni induttive alternativa con l’utilizzo di isobutilmetilxantina (IBMX) e di dibutirrile AMPc o forscolina e idrossianisolo butilato. Le cellule esprimono inoltre il trkA, un recettore per il NGF e presentano canali di voltaggio per il potassio. Nonostante ciò la differenziazione di queste cellule è limitata all’espressione di questi geni precoci. Non sono stati osservati markers caratteristici di neuroni maturi, oligodendrociti o astrociti. Nonostante questo, tali studi sono stati significativi perché hanno dimostrato che nel tessuto adiposo risiede una popolazione di cellule staminali adulte capaci di differenziarsi in progenitori di cellule neuronali che possono essere utilizzate nella rigenerazione di un tessuto neuronale danneggiato o perduto. Risultati positivi ottenuti su modelli animali in vivo ha generato ottimismo in campo di rigenerazione tissutale nervosa,; l’utilizzo di cellule staminali adulte, ottenute dal tessuto adiposo sono una potenziale fonte di progenitori cellulari neuronali che possono avere un’importanza fondamentale nelle applicazioni cliniche neurologiche.

- Angiogenesi:
recentemente sono stati effettuati studi volti a determinare il contributo delle diverse linee cellulari della SVF isolata dal tessuto adiposo. Gli sudi si sono basati sull’identificazione di marker cellulari di superficie.
Si è osservato che le ASCs non esprimono i markers cellulari tipici delle cellule ematopoietiche differenziate, né i marcatori presenti sia sui leucociti che sulle cellule endoteliali come il CD31, presente invece sulle cellule staminali embrionali. Si pensa quindi che nella SVF siano presenti oltre alle ASCs , anche precursori di cellule endoteliali.
E’stato però notato che il CD34, espresso dalle cellule staminali ematopoietiche, viene espresso anche dalle ASCs a vari gradi di differenziazione. Le ASCs sono CD34 positive all’interno ella frazione vascolo-stromale, ma questo indicatore viene perso durante la coltura in vitro.
Le cellule staminali adipose inoltre esprimono e secernono citochine ematopoietiche come il fattore stimolante le colonie macrofagi che (M-CSF), il fattore stimolante le colonie granulocita rie e macrofagiche (GM-CSF); fattori anti-apoptotici, fattori di crescita angiogenici come il VEGF, il PIGF, il bFGF, l’angiogenina; TGF-beta e il fattore di crescita epatocita rio. In condizioni di ipossia le cellule aumentano notevolmente la secrezione del VEGF che determina l’aumento del numero delle cellule endoteliali e la diminuzione del tasso apoptotico.
Miranville e colleghi hanno riportato dati atti a mostrare la presenza di cellule all’interno del tessuto adiposo, capaci di differenziarsi in endotelio. Tali cellule sono CD34+/CD31–. In vitro hanno mostrato la capacità di differenziarsi in cellule esprimenti il fattore di Von Willebrand e il CD31, entrambi indicatori di cellule endoteliali mature. Ancora più importante, è stata dimostrata la capacità di queste cellule di aumentare il flusso sanguigno e la densità capillare in un ratto in cui era stata indotta ischemia a livello degli arti inferiori.
Nonostante questi dati, ancora non è ben chiara la potenziale differenziazione delle ASCs in cellule endoteliali. Mente alcuni autori ritengono che le cellule staminali adipose diano origine alle cellule implicate neovascolarizzazione, altri pensano che il ruolo delle ASCs nell’angiogenesi sia da attribuire alla loro capacità di secernere fattori come il VEGF, piuttosto che alla loro capacità differenziativa.

- Pancreatica:
Timper e colleghi hanno avuto successo nel determinare il differenziamento delle ASCs in cellule con fenotipo pancreatico tramite l’uso di activina A, exendina 4, HGF e penta gastrina nel mezzo di coltura. Le cellule hanno mostrato così esprimere fattori di trascrizione pancreatici endocrini come Isp-1., Pax-6 e Ipf-1. Ancora più importante, le cellule differenziate esprimono ormoni pancreatici endocrini come l’insulina, il glucagone e la somatostatina.

- Epatica:
le ASCs trattate con HGF (fattore mitogeno che gioca un importante ruolo nella rigenerazione del fegato), oncostatina M (OM, citochina appartenente alla famiglia delle IL-6 che regola la differenziazione epatica), e solfossido dimetile, diventano capaci di esprimere in coltura albumina e alfa-fetoproteina; Tali cellule, simil-epatociti, acquisiscono la capacità di incorporare lipoproteine a bassa densità per la produzione di urea. Esperimenti su modelli animali hanno mostrato che le ASCs impiantate in un topo sottoposto a epatectomia parziale si sono integrate con gli epatociti avendo la possibilità di promuovere la rigenerazione epatica. Nonostante gli e gli studi e i dati siano ancora pochi, il risultati appaiono comunque incoraggianti.


Nuove applicazioni cliniche

Le nuove terapie basate sull’uso di cellule staminali per la riparazione e la rigenerazione di vari tessuti e organi offre oggi un cambiamento che può fornire soluzioni terapeutiche alternative per un gran numero di malattie e condizioni cliniche diverse. Con l’emergere della medicina rigenerativa e la ricostruzione tissutale, è aumentato notevolmente l’interesse verso il tessuto adiposo che, oltre ad essere un vero e proprio organo endocrino, possiede la capacità di potenziale terapeutico grazie al suo contenuto in cellule staminali.

Terapia rigenerativa.
Sulle basi di esperimenti in vitro e studi preclinici, le ASCs sono state applicate in vari campi clinici come terapia rigenerativa di tessuti diversi.
Le cellule staminali adipose, grazie allaloro capacità differenziativa ma anche paracrina, possono essere utilizzate per la rigenerazione cutanea. Secernendo fattori di crescita, riescono a controllare e stimolare la rigenerazione delle cellule della cute danneggiate. E’ stato visto che le ASCs favoriscono e velocizzano la guarigione delle ferite, ulcere e difetti cutanei, migliorano la pigmentazione della pelle e promuovono la crescita dei capelli attraverso l’attivazione delle cellule vicine. L’ipossia migliora le funzioni rigenerative delle ASCs tramite l’incremento della secrezione dei fattori di crescita.
In uno dei primi caso clinici, le cellule staminali adipose sono state utilizzate per il trattamento rigenerativo di difetti estesi del cranio causati da traumatismo. L’utilizzo di cellule autologhe spongiose dell’osso iliaco in combinazione con ASCs, colla di fibrina e materiali di supporto biodegradabili, hanno mostrato la formazione di nuovo osso ottenuto una continuità del cranio quasi completa.
Sono utilizzate inoltre nel trattamento di difetti del profilo del volto dovuti a microsomia craniofaciale, tarumi o semplicemente all’età.
L’innesto di grasso libero combinato con ASCs gioca un ruolo molto importante nel mantenimento del volume del tessuto adiposo iniettato. Per questo motivo l’utilizzo di innesti di grasso con cellule staminali isolate dall’innesto stesso è divenuta un’alternativa all’aumento chirurgico dei tessuti molli, nei casi di perdita di tessuto mesenchimale, dovuti a traumatismi, resezioni tumorali o insulti vascolari. Ultimamente tale tecnica viene utilizzata anche per l’aumento del seno in chirurgia estetica riportando buoni risultati.
La rigenerazione del tessuto adiposo è molto promettente nella ricostruzione del seno in pazienti che hanno subito una mastectomia per cancro della mammella. Studi clinici hanno dimostrato che le ASCs hanno impiego anche in gastroenterologia, in quanto sono state usate per il trattamento delle fistole in pazienti affetti da morbo di Crohn, determinandone la chiusura.
Le ASCs hanno un notevole potenziale anche nella guarigione delle ferite e nel trattamento delle ulcere di qualsiasi origine.
La perdita o il difetto di altri tessuti come la cartilagine, può essere trattata con le ASCs ad esempio nella microtia congenita o difetti acquisiti per trauma o resezioni tumorali. Alcuni autori hanno dimostrato i polimeri di acido poliglicolico (PGA) con l’acido poli-L-lattico (PLLA) e l’acido poli-lattico-glicolico (PLGA) sono utilizzabili come scaffolds ideali per la rigenerazione di questo tessuto di supporto.
Possono essere utilizzate anche nel trattamento delle articolazioni artritiche o partecipare alla ricostruzione articolare.